服务背景 ： 基因编辑已从一种基础研究工具快速迈入临床应用，其已经是一种变革性的产生药物手段，但基因编辑介导的细胞和基因治疗仍面临着脱靶效应、免疫原性等安全性挑战。2021年4月，《Nature》在线发表题为“The NIH Somatic Cell Genome Editing program”的文章，标志着美国体细胞基因组编辑计划启动实施，该计划旨在开发新技术和调整现有工具，抓住机遇，定义和减轻安全风险，并将治疗性基因组编辑扩展到最具挑战性的体细胞组织环境中，推动基因组编辑向更广泛的人类疾病治疗应用领域发展。因此，在不断开发和优化基因编辑工具的同时，利用细胞、类器官、动物模型等对基因编辑工具的有效性和安全性进行全面评估也凸显尤为重要，可以为基因编辑技术更广泛的应用奠定坚实理论基础。
同时，近年来一系列新的Cas蛋白，包括Cas12、Cas13和Cas14等被鉴定发现具有附属切割活性，在此基础上研发了基于CRISPR基因编辑的核酸快速检测平台，基于CRISPR技术的核酸检测具有速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便、价格便宜等优势，被誉为“ 下一代分子诊断”系统，极大地拓展了CRISPR的适用性及应用领域。
国家人类生殖和健康资源库以提升自主开发利用水平为目的，通过培育基因编辑核心关键技术、底层工具的自主安全可控能力，全面提升遗传资源库高质量挖掘和利用水平，研发了包括：（1）自主开发制备具有不同酶学特征的碱基编辑器工具质粒，构建稳定表达碱基编辑蛋白的工具细胞系，建立内涵丰富、自主可用的碱基编辑工具库；（2）研发了具有自主知识产权的新型碱基编辑工具，提高编辑效率、降低脱靶率、突破PAM序列区限制；（3）建立了造血干细胞（HSC）碱基编辑共性技术体系，评估新型碱基编辑工具纠正模型造血干细胞基因缺陷有效性和安全性。
服务对象：山东大学附属儿童医院，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，苏州大学
服务情况：探索使用新型自主研发的基因组编辑工具CRISPR/Cas12a开展神经和肝脏遗传性疾病类器官基因组编辑应用研究，评价遗传性疾病类脑和类肝器官基因组编辑效率、脱靶效应、基因编辑效果及非预期效应，为基因编辑疗法评价提供共性基础技术支撑；提供碱基编辑工具质粒，研发基于慢病毒类病毒颗粒的基因编辑工具递送系统，建立递送基因编辑工具的慢病毒类病毒颗粒制备技术体系，探索优化慢病毒类病毒颗粒递送系统；提供碱基编辑工具技术支持，使用AAV病毒载体递送基因编辑工具对苯丙酮尿症PAH小鼠开展了基因编辑治疗方案的测试。
取得成效：
1.完成2种遗传病iPS细胞的编辑修复与评估，并制备相应的脑/肝类器官
（1）ATP7B缺陷导致的肝豆状核变性iPS细胞的编辑修复与评估
采用ABE8e-NG + sgRNA碱基编辑器修复WD患儿来源的iPS细胞中ATP7B基因致病突变c.2975 C>T，嘌呤霉素杀伤后，Sanger测序检测编辑效率为95%，流式分选获得编辑效率为100%的单克隆。免疫荧光检测了iPS细胞中干细胞标志物OCT4，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81，NANOG的蛋白的高表达；核型鉴定表明诱导得到的iPS细胞核型正常；定量PCR检测了iPS细胞中内源性OCT4,SOX2和NANOG的表达；拟胚体（EBs）体外分化实验表明诱导得到的iPS细胞能够分化出三胚层，具有多能性分化的能力，Sanger测序验证c.2975 C>T位点突变已经被修复。qRT-PCR检测修复后ATP7B的mRNA表达水平，结果显示ATP7B的mRNA水平升高。Western Blot检测结果表明，ATP7B修复后蛋白水平显著升高。
图1 ATP7B基因c.2975 C>T 突变位点sgRNA及编辑窗口示意图
（2）ATP7B突变编辑后iPS细胞制备肝类器官
对2例ATP7B缺陷导致WD及1例ATP7B 的iPS细胞进行了肝类器官的诱导分化。在分化不同阶段，利用qRT-PCR检测不同阶段的分子标记物表达水平；免疫荧光检测肝类器官中干性标志物NANOG、OCT4，中胚层标志物SOX17、FOXA2以及肝脏标志物HNF4α、α1-Antitrypsin、AFP、Alb、CK18、CYP3A4等的表达；ELISA方法来检测肝类器官分泌Alb的能力；利用过碘酸雪夫染色检测肝类器官中糖原（PAS）分布；利用Dil-ac-LDL荧光染色检测肝类器官上低密度脂蛋白（LDL）的摄取过程以及受体的分布情况；利用偶联酶反应检测肝类器官支链氨基酸BCAA的代谢能力。结果表明，诱导的肝类器官高表达肝表面标志物，且具有肝的代谢功能，可以合成糖原，吞噬LDL，吸收和释放吲哚。
图2 iPS细胞肝类器官表面标志物鉴定及功能检测
利用定量PCR和WB技术对正常组、病例组及病例修复组进行ATP7B表达水平的评估，结果发现与正常对照相比，病例组的表达水平显著降低，进行碱基修复后可提高其表达水平。
（3）碱基编辑器修复MSUD肝类器官
采用ABE8e-NG + sgRNA碱基编辑器直接修复MSUD患儿iPS细胞肝类器官中BCKDHB基因致病突变c.965 C>T，编辑效率100%，而且修复后的肝类器官的BCKDHA和BCKDHB mRNA和蛋白表达显著提高。
对编辑后的类器官进行肝表面标志物和肝脏功能鉴定，结果显示编辑后的肝类器官不影响肝表面标志物（CYP3A4，ALB，AFP）的表达。
使用Cas-Offinder对ABE8e编辑BCKDHB c.965C>T位点导致的sgRNA依赖型潜在脱靶位点进行预测并进行深度测序，结果显示潜在脱靶位点未发现显著性脱靶编辑。
图3 肝类器官编辑后脱靶检测分析图
2.基于慢病毒类病毒颗粒的基因组递送系统研发
制定基于慢病毒载体和人泡沫病毒的类病毒包装策略，并在基础上建立了3套类病毒颗粒的递送系统，其中以慢病毒载体的类病毒系统其中1套可以用于递送基因编辑mRNA，1套用于递送基因编辑工具RNP；基于HFV的类病毒系统用于递送基因编辑工具的RNP，共构建相关质粒17个。建立了针对递送mRNA的类病毒颗粒中mRNA ddPCR的方法。
将类病毒颗粒相关质粒在293T细胞内进行包装，收集获得了多种类病毒颗粒，其中包裹有萤火虫荧光素酶的类病毒颗粒，经过化学发光检测，结果表明类病毒可以有效包裹FLUC蛋白，并在细胞水平上可以有效感染293T细胞，证明基于HIV和HFV类病毒包装系统不仅可以包裹靶蛋白，还可以将靶蛋白递送到目的基因中，可以成为蛋白递送的有效工具。以HIV GAG和HFVGAG为基础，制备了靶向PD1基因的类病毒颗粒lvlp-HIVgag-Cas9/PD1sg6和Lvlp-HFVgag-Cas9/PD1sg6，投射电镜下可以直接观察到类病毒颗粒，P24快速检测卡可以检测出类病毒颗粒内的GAG蛋白。建立了稳定表达PD1-FLUC融合蛋白的稳定细胞系293T-PD1-Fluc作为指示细胞，包裹CAS9/PD1sg6的类病毒颗粒在指示细胞系上表现出有效的基因编辑效果。
3.构建罕见病人胚胎干细胞资源库
利用CRISPR/Cas9技术对既往筛选的与疾病密切相关的人特异性基因在人胚胎干细胞中分别进行敲除，目前已经完成了50个细胞株的构建，并对其中25株细胞开展了筛选，通过非定向分化（类胚体Embryoid Body）检测外胚层分子标记：Sox1和Nestin，初步筛选出一些发现有变化的基因（其中低于0.5或高于4为有变化的基因），后续可以进行深入的定向分化以及更深层次的过表达小鼠模型开展机制研究。